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È un saggio di mobilità elettroforetica per studiare le interazioni tra presunti fattori di trascrizione e i possibili oligonucleotidi da essi legati. In vitro si sintetizza la sonda: un oligonucleotide duble strain di nostro interesse e si marca terminalmente con P32. Si incuba poi con estratti proteici provenienti da cellule che esprimono i geni studiati, nel momento di massima espressione. Se l’oligonucleotide è davvero un elemento di cis regolazione esso dovrebbe venir legato da una delle proteine dell’estratto.
Per questo motivo si carica il campione su gel di poliacrilamide insieme a un campione nn contente l’estratto proteico ovvero con la sola sonda, e si fa avvenire la corsa elettroforetica. Se l’oligonucleotide ha effettivamente legato un fattore di trascrizione la banda avrà corso molto più lentamente, sia per il peso della molecola che perché il fattore di trascrizione riduce la carica netta della molecola, e sarà quindi shiftata rispetto alla banda del campione contenente solo l’oligonucleotide. Possiamo comunque effettuare una serie di controlli per verificare che il legame non sia stato aspecifico: incubando contemporaneamente con una sonda identica ma non marcata radio attivamente: se il legame è specifico dovrebbe diminuire la banda shiftata perché la proteina legherà anche la sonda non marcata. usando un oligonucleotide modificato nella presunta regione legata: la banda dovrebbe rimanere identica perché se il legame è specifico la sonda modificata non si complesserà con il fattore di trascrizione.
Possiamo inoltre usare una serie di sonde, ognuna mutata in un solo punto della sequenza di regolazione. Facendo poi il saggio EMSA andrò a vedere un decremento nell’intensità della banda shiftata se vengono mutati i nucleotidi del core.
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