Chiamato spesso Yeast  Two Hybrid (YTH) e una delle metodiche utilizzate per lo studio delle interazioni proteina-proteina.

Come sappiamo i fattori di trascrizione sono costituiti tra l’altro da un dominio di legame al DNA: Binding Domain (BD); e da un dominio di attivazione della trascrizione: Activation Domain (AD). In realtà i due domini non devono necessariamente essere parte dello stesso peptide per risultare funzionanti, ma è sufficiente che essi siano vicini.

Il YTH sfrutta proprio questa caratteristica, in particolare del fattore di trascrizione GAL4.  Supponendo di voler saggiare l’interazione tra le proteine X e Y si creano due proteine di fusione a partire da due plasmidi: Gal4BD-X   e   Gal4AD-Y.

Naturalmente dobbiamo stare molto attenti affinchè nella creazione dei plasmidi BD-X e AD-Y risultino in frame.

Come microorganismo viene appunto utilizzato il lievito (Yeast) , sfruttando la sua capacità di avere una fase aploide e una fase diploide: andiamo a trasformare Mat-a con il plasmide contenente Gal4-BD-X e Mat-a  con l’altro. Poi li facciamo accoppiare e il ceppo diploide a/a conterrà entrambi i plasmidi.

Nei plasmidi inseriremo dei marcatori di selezione per mutanti auxotrofici, quindi ad esempio per due aminoacidi: i due ceppi aploidi dovranno essere mutati per entrambi gli aminoacidi e faremo crescere le colture trasformate su terreno minimo.

Se L’interazione proteina-proteina avviene X andrà a legare Y, il dominio AD si troverà in prossimità del DNA e potrà andare a promuovere la trascrizione del gene reporter. I lieviti dovranno essere Gal4^- (difettivi per Gal4).

Solitamente il gene reporter è LacZ che codifica per la beta-galattosidasi, in grado di idrolizzare l’ X-gal in un composto blu: le colonie in cui avviene il two Hybrid saranno blu se nel terreno sarà presente X-gal.

Dovremo però effettuare una serie di controlli per evitare falsi positivi:

·         X non deve possedere intrinseche capacità di attivazione la trascrizione: potremo effettuare il controllo clonando solo il plasmide BD-X;

·         Y non deve possedere intrinseche capacità di legame al DNA: in maniera analoga effettueremo il controllo utilizzando solo il plasmide AD-Y;

·         X non deve avere siti di legame per AD: il controllo lo effettueremo clonando da un lato il Plasmide BD-Y e dall’altro un plasmide contenente soltanto AD;

·         Y non deve avere sit di legame per BD: in questo caso cloniamo da un lato AD-Y e dall’altro un plasmide contenente solo BD;

·         Non ci deve essere trascrizione basale di beta-galattosidasi: controlliamo le colonie prima del two Hybrid.

NB. Spesso si utilizza una metafora chiamando X= Bait (esca) e Y= Pray (preda).

Varianti del YTH

Sono state sviluppate diverse varianti del Two Hybrid System:

Reverse Two Hybrid
è un normale Two Hybrid Che però utilizza come gene reporter Ura3, gene che codifica per una proteina in grado di trasformare l’acido fluoroorotico (FOA) in 5fluoro uracile. Mentre il FOA è assolutamente innocuo per le cellule il 5FU si inserisce in DNA ed RNA portando le cellule all’apoptosi. Per cui si replica la piastra (replica plating) in una contenente FOA e in una conterreno minimo: le colonie che non cresceranno sul FOA saranno quelle in cui è avvenuto il Two Hybrid correttamente. Spesso questa tecnica serve per evitare i falsi positivi che possono risultare da trascrizione basale di beta-galattosidasi.

One Hybrid
Viene creata solo una proteina di fusione, quindi anche un solo plasmide, costituita da BD più la proteina da saggiare. È utile per studiare prteine che possono essere esse stesse attivatori di trascrizione.

Three Hybrid

dato che le proteine X e Y non  interagiscono si può utilizzare una terza molecola, che può essere una terza proteina ma + spesso è un RNA, per far avvenire l’interazione.

Questa terza molecola può essere già presente all’interno del lievito: in questo caso non è un vero e proprio triplo ibrido.

Con tutte le tecniche viste pero si ha una limitazione: possono essere studiate solo interazioni tra proteine nucleari.