Si intende per trasfezione l’introduzione di molecole di varia natura (DNA,RNA, proteine) in cellule eucaristiche. Solitamente comunque si fa riferimento all’introduzione di acidi nucleici.

In questo ultimo caso abbiamo tre fasi:

1. internalizzazione;
2. trasporto nel nucleo e stabilizzazione(spesso questo passaggio non è ben compreso, ma avviene);
3. espressione del gene trasfettato.

Esistono diversi metodi:

• Chimici: Calcio fosfato , lipidi cationici e altri;
• Fisici: elettroporazione, microproiettili, microiniezione;
• Transinfezione

In ogni caso per valutare una tasfezione dobbiamo stare attenti a diverse caratteristiche:

• Alta efficienza;
• Trasporto nel corretto compartimento cellulare;
• Minima interferenza sulla fisiologia cellulare;
• Assenza di tossicità per la cellula e per l’operatore;
• Facilità d’uso;
• Alta riproducibilità.

Metodi Chimici

Tutti i metodi chimici si basano sul principio che molecole cariche positivamente reagiscono con  il DNA carico negativamente, formando complessi  neutri che attraversano facilmente la membrana. Si fanno formare i complessi e poi si gocciolano sulle colture. I complessi vengono inglobati facilmente dalle cellule.
Si deve utilizzare il reagente in leggero eccesso per aumentare la carica positiva del complesso che interagisce con la membrana cellulare carica negativamente.

Calcio Fosfato
Si fa incubare il DNA con CaCl2, il Ca2+ interagisce con le carice negative del DNA e si formano i complessi.
Vantaggi: è molto semplice ed economico.
Svantaggi: è poco riproducibile perché la forma e le dimensioni dei complessi possono variare interferendo con la trasfezione

Lipidi Cationici
Sono miscele di lipidi neutri e carichi positivamente, che creano in soluzione liposomi in cui i lipidi carichi sono tutti  rivolti verso l’esterno. Possono quindi creare complessi liposomi-DNA.
Vantaggi: alta efficienza e buona riproducibilità.
Svantaggi: costosa.

Metodi Fisici

Elettroporazione
Le cellule sospese in un buffer adeguato in cui è presente il DNA che vogliamo trasfettare vengono poste in specifici contenitori che presentano lastre metalliche,e qui sono sottoposte a uno shock elettrico che causa una grande variazione del potenziale di membrana con una conseguente apertura di pori u di essa; attraverso questi pori il DNA è in grado di entrare nella cellula. Dopo lo shock le cellule tornano al loro normale stato.
Vantaggi: efficiente in quasi tutti i tipi cellulari.
Svantaggi: si ha un’elevata mortalità delle cellule(50/70%) per cui sono necessari materiali di partenza abbondanti (Le cellule che rimangono in vota però sono quasi tutte trasfettate); è costosa.

Microproiettili
Vengono ricoperte microparticelle di oro o tungsteno  con il DNA. Queste vengono poi sparate con apparecchiature adatte direttamente all’interno della cellula. È una tecnica poco utilizzata

Microiniezione
Può essere trasfettata una cellula per volta attraverso microiniettoti: le cellule vengono poste su vetrini specifici su un tavolo antivibrazione; su di esso un microscopio spesso collegato a un monitor. Si utilizza un micromanipolatore per muovere il capillare di vetro in cui è presente il materiale da iniettare. Poi un iniettore regola le due pressioni critiche: P di Holding, che evita l’ingresso per capillarità di materiale dall’esterno e la fuoriuscita di quello all’interno, e della P di Microiniezione, che permette la fuoriuscita del materiale nella cellula.
È una tecnica complessa per cui è necessaria grande pratica dell’operatore.
Si divide in tre fasi:

1. si porta il capillare nel campo del microscopio;
2. si abbassa nella cellula portandolo a toccare la membrana;
3. si entra nella cellula e si rilascia il materiale nel compartimento desiderato.

Vantaggi: è molto efficiente, è facile regolare il livello di espressione di questi geni e consente di decidere il compartimento in cui si deve rilasciare il materiale.
Svantaggi: si trasfetta una cellula per volta,costoso, ci vuole molta pratica dell’operatore.

È la tecnica usata per la genesi di animali transgenici.

(in figura la schematizzazione di un microiniettore).

Transinfezione

Si avvale dell’uso di genomi virali ingegnerizzati, sfruttando la capacità del virus di trasmettere DNA. Tra i virus studiati il più interessante è sicuramente Retrovirus.

Retrovirus
Come sappiamo nel genoma dei retrovirus sono presenti sequenze di integrazione e sequenze necessarie per la replicazione: Gag(proteine del core) Pol (trascrittasi inversa) ed Env (proteine dell’envelope). Nei vettori retrovirali noi inseriremo le sequenze di integrazione ma Gag Pol ed Env.
Per fare formare le particelle virali a partire dai plasmidi inseriremo questi in linee cellulari specifiche che hanno integrato Gag-Pol -Env. In queste cellule si forma quindi la particella in cui si inserisce il plasmide virale. Le particelle virali complete lisano le cellule e fuoriescono. Possono essere raccolte dal terrenodi coltura e sparse sulle cellule di nostro interesse; qui le particelle virali potranno solo integrare il proprio genoma, ma non possedendo la sequenza necessaria non potranno ricostituire la particella e quindi non saranno in grado di lisare le cellule.
Vantaggi: alta efficienza.
Svantaggi: complessa e lunga.

Note

Tutte queste tecniche vengono utilizzate per:

• Studio della regolazione genomica;
• Analisi di funzione ed espressione delle proteine;
• Generazione di organismi transgenici;
• Terapia genica in vivo ed ex-vivo.